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ELISA實驗中不容忽視的實驗細(xì)節(jié)

更新時間:2024-03-04    點擊次數(shù):2823

  ELISA實驗中不容忽視的實驗細(xì)節(jié)

 

  ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測定。但ELISA測定中影響因素較多,而且其操作中有一定的技術(shù)要求,在檢測過程中除正常反應(yīng)外,有時常見到一些錯誤的結(jié)果。引起ELISA測定錯誤結(jié)果的原因主要有:①標(biāo)本因素;②試劑因素;③操作因素。下面就一些常見ELISA操作過程中的問題BUNSEN本生小編一一分析。

  >> 樣品稀釋

  酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng),如果血清不稀釋,不可避免會產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng),出現(xiàn)假陽性。因此,國外檢測血清抗體的試劑盒,均規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù),以降低非特異性反應(yīng),使特異性的抗原抗體反應(yīng)充分體現(xiàn)出來。一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過大量試驗確定,以保證試驗的靈敏度和特異性。但是,有些用戶未能嚴(yán)格按使用說明書操作,如某些產(chǎn)品應(yīng)取10μl樣品進(jìn)行稀釋,個別用戶取5μl甚至1μl樣品進(jìn)行稀釋,由于吸嘴上不可避免地沾有樣品以及微量移液器的精度不夠,因此造成樣品稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確,檢測結(jié)果出現(xiàn)問題。

  >> 試劑盒平衡

  試劑盒中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗前平衡至室溫(約25℃),一般需在室溫放置20~30分鐘以上。平衡時間太短會造成試劑混勻不夠,樣品孵育時間相對縮短,ELISA反應(yīng)不夠充分。冬季室溫低,可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。

  >> 樣品和試劑的混勻

  稀釋前、后的樣品必須充分混勻,所有試劑在加樣前也須搖勻,以保證試驗的均一性。

  >> 加樣

  在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中,必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意的關(guān)鍵點是:加樣不可太快,要避免加在孔壁上部,不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快,無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū),易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。所以,有時候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測定為陽性,下次測定為陰性,往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。

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